微生物实验室污染废弃物（包括培养基残渣、菌液离心管、接种环、实验耗材等）常携带大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等致病菌，部分还含耐热芽孢（如枯草芽孢杆菌黑色变种），若灭菌不透彻，不仅会造成实验室交叉污染，还可能通过气溶胶传播引发公共卫生安全风险。传统灭菌工艺多采用固定参数（121℃、20 分钟、重力排气），存在灭菌死角、芽孢未全部灭活、玻璃耗材破损率高（超 5%）等问题，难以满足 GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》中 “灭菌合格率 100%、生物安全风险可控" 的严苛标准。本实验以立式高压蒸汽灭菌器为核心设备，通过优化关键参数，构建适配不同污染废弃物的安全高效灭菌体系，为微生物实验室生物安全管控提供技术支撑。
一、实验材料与方法
（一）实验材料
污染废弃物样本：制备三类典型污染废弃物 —— 含大肠杆菌（ATCC 25922）的 LB 液体培养基（浓度 1×10⁶CFU/mL）、沾有金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）的接种环、含枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC 9372，耐热芽孢指标菌）的离心管，均模拟实验室实际污染场景制备；
生物指示剂：采用嗜热脂肪芽孢杆菌 ATCC 7953 菌片（含菌量 1×10⁶-1×10⁷CFU / 片），作为灭菌效果核心检测指标（芽孢杀灭率需达 100%）；
设备与耗材：50L 立式高压蒸汽灭菌器（支持温度 105-134℃、压力 0.05-0.2MPa 可调，带数显参数记录功能）、生物安全柜、恒温培养箱（37℃）、无菌培养皿、LB 固体培养基、玻璃离心管（10mL）、金属接种环。
（二）实验方案
采用正交实验设计（3 因素 3 水平），以芽孢杀灭率（primary 指标，目标 100%）、耗材破损率（secondary 指标，目标≤1%）、灭菌能耗为评价指标，系统优化关键参数：
实验因素与水平：
灭菌温度（A）：121℃、125℃、130℃（覆盖常规灭菌与强化灭菌温度范围）；
保温时间（B）：15 分钟、20 分钟、25 分钟（匹配不同污染物耐热性）；
排气方式（C）：重力排气（传统方式）、脉动排气（3 次脉动）、阶段排气（升温段 1 次 + 保温前 2 次）；
实验流程：
每批次将 3 类污染废弃物与 5 片生物指示剂均匀放置于灭菌器内（包括腔体角落、上层、下层等易形成死角的位置）；
按设定参数启动灭菌程序，结束后取出生物指示剂，在 37℃恒温培养箱中培养 48 小时，观察是否有菌落生长（无生长则判定灭菌合格）；
统计芽孢杀灭率（合格生物指示剂量 / 总投放量 ×100%）与耗材破损率（破损离心管 / 总投放量 ×100%），同步记录灭菌过程能耗数据。
二、实验结果与优化分析
（一）参数影响规律分析
灭菌温度的影响：
121℃时，芽孢杀灭率仅 92%，主要因部分芽孢（如枯草芽孢杆菌黑色变种）耐热性强，常规温度无法全部灭活；
125℃时，芽孢杀灭率提升至 100%，且玻璃耗材无明显破损（破损率 0.5%），温度升高加速了蒸汽对芽孢细胞壁的破坏，同时未超出耗材耐热阈值；
130℃时，虽能维持 100% 芽孢杀灭率，但高温导致玻璃离心管热胀冷缩应力增大，破损率升至 3%，且能耗较 125℃增加 18%，经济性不佳。
保温时间的影响：
15 分钟保温时，灭菌器腔体内部温度未全部均匀，角落位置生物指示剂出现阳性反应（杀灭率 94%），灭菌不透彻；
20 分钟保温时，腔体温度均匀性提升（各点位温差≤±0.5℃），芽孢杀灭率达 100%，耗材破损率控制在 0.5%；
25 分钟保温时，灭菌效果无显著提升，但能耗增加 10%，且长时间高温易导致培养基残渣碳化，附着于灭菌器内壁增加清洁难度。
排气方式的影响：
重力排气依赖热蒸汽自然排出冷空气，易在腔体底部形成冷空气滞留区（灭菌死角），芽孢杀灭率仅 95%；
阶段排气通过分阶段排气减少冷空气残留，杀灭率提升至 99%，但仍存在局部死角；
脉动排气通过 3 次抽真空 - 注入蒸汽的循环，透彻排出腔体及废弃物内部的冷空气，蒸汽穿透力显著增强，芽孢杀灭率达 100%，且灭菌均匀性最好（各点位合格率一致）。
（二）最佳参数组合确定
综合三项指标优化结果，确定最佳灭菌参数为：灭菌温度 125℃、保温时间 20 分钟、脉动排气方式。此参数组合下，芽孢杀灭率 100%，玻璃耗材破损率 0.5%，单批次灭菌能耗较传统工艺（121℃、20 分钟、重力排气）降低 12%，实现 “安全、低损、节能" 的三重目标。
三、多场景应用验证
将最佳参数应用于微生物实验室不同类型污染废弃物处理，连续开展 30 批次验证实验：
普通致病菌废弃物（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌污染样本）：30 批次检测均无致病菌残留，灭菌合格率 100%，较传统工艺缩短灭菌时间 5 分钟，适配实验室高频次废弃物处理需求；
耐热芽孢污染废弃物（枯草芽孢杆菌黑色变种、炭疽杆菌模拟样本）：所有生物指示剂培养后均无菌落生长，透彻杜绝芽孢类致病菌传播风险；
易破损耗材（玻璃离心管、容量瓶）：破损率稳定在 0.3%-0.5%，较传统工艺（破损率 5%）降低 90%，减少实验耗材浪费；
生物安全合规性验证：实验数据（参数记录、灭菌效果报告）可全程追溯，满足 GB 19489-2008 对生物安全二级实验室的灭菌记录要求，顺利通过实验室资质复审。
四、操作规范与注意事项
为确保优化方案落地效果，需配套标准化操作流程：
装载规范：废弃物需分类装载（固体与液体分开），装载量不超过灭菌器腔体容积的 80%，且留有蒸汽流通间隙（避免堆叠导致灭菌死角）；
排气确认：脉动排气阶段需观察设备压力表，确保每次抽真空后压力降至 0.02MPa 以下，再注入蒸汽；
冷却处理：灭菌结束后采用自然冷却（避免快速泄压导致玻璃耗材炸裂），待压力降至常压、温度低于 80℃后再开启舱门；
定期校准：每 3 个月用标准温度计与压力计校准灭菌器，确保温度、压力显示精度（偏差≤±0.5℃、±0.01MPa）。
五、结论
本实验通过正交设计优化立式高压蒸汽灭菌器参数，确定 125℃、20 分钟、脉动排气的最佳组合，解决了传统灭菌工艺存在的灭菌不透彻、耗材破损率高、能耗大等痛点。该方案可实现微生物实验室各类污染废弃物的 100% 灭菌合格，同时降低耗材损耗与能耗成本，满足生物安全管控与合规要求。其标准化操作流程与可追溯的实验数据，为微生物实验室污染废弃物处理提供了精准、高效的技术参考，对提升实验室生物安全水平具有重要实践意义。
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